雙光子熒光顯微鏡是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù)。

　　雙光子激發(fā)的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收 2 個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子，在經(jīng)過(guò)一個(gè)很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時(shí)間后，發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)較短的光子;其效果和使用一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，為了不損傷細(xì)胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脈沖寬度只有 100 飛秒，而其周期可以達(dá)到 80 至 100 兆赫。在使用高數(shù)值孔徑的物鏡將脈沖激光的光子聚焦時(shí)，物鏡的焦點(diǎn)處的光子密度是高的，雙光子激發(fā)只發(fā)生在物鏡的焦點(diǎn)上，所以雙光子顯微鏡不需要共聚焦針孔，提高了熒光檢測(cè)效率。為形態(tài)學(xué)、分子細(xì)胞生物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、和藥理學(xué)等研究領(lǐng)域中重要的研究手段。

　　1.雙光子顯微鏡出現(xiàn)的背景----傳統(tǒng)激光共聚焦顯微鏡的兩大局限:

　　1)一是光毒性現(xiàn)象：因?yàn)楣簿劢沟尼樋妆仨氉銐蛐∫垣@得高分辨率的圖像，而孔徑小又會(huì)擋掉很大部分從樣品發(fā)出的熒光，包括從焦平面發(fā)出的熒光，相應(yīng)的，激發(fā)光必須足夠強(qiáng)以獲得足夠的信噪比;而高強(qiáng)度的激光會(huì)使熒光染料在連續(xù)掃描過(guò)程中迅速褪色，熒光信號(hào)會(huì)隨著掃描進(jìn)程度進(jìn)行變得越來(lái)越弱。

　　2)光毒作用是另外一個(gè)問(wèn)題，在激光照射下，許多熒光染料分子會(huì)產(chǎn)生諸如單態(tài)氧或自由基等細(xì)胞毒素，所以實(shí)驗(yàn)中要限制掃描時(shí)間和激發(fā)光的光功率密度以保持樣品的活性。在針對(duì)活性樣品的研究中，尤其是活性樣品生長(zhǎng)、發(fā)育過(guò)程的各個(gè)階段，光漂白和光毒現(xiàn)象使這些研究受到很大的限制。

　　2.為什么說(shuō)雙光子顯微鏡一般不需要配備紫外激發(fā)激光器?

　　雙光子顯微鏡技術(shù)是建立在雙光子激發(fā)效應(yīng)的基礎(chǔ)上的一種熒光激發(fā)技術(shù)：熒光染料分子可以同時(shí)吸收低能量的兩個(gè)光子而被激發(fā)(兩個(gè)光子到達(dá)熒光分子的時(shí)間間隔小于1飛秒)，其激發(fā)效果可以等同于吸收一個(gè)1/2波長(zhǎng)的高能量光子。例如，吸收兩個(gè)紅色波長(zhǎng)的光子，相當(dāng)于一個(gè)吸收紫外的分子。長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子不易被細(xì)胞吸收，因此對(duì)活細(xì)胞的光毒性減少，也降低了光漂白。這樣即起到紫外激發(fā)的功能，又避免了紫外光線對(duì)樣品的傷害。

　　3.雙光子顯微鏡的激光器有何特別之處?

　　雙光子吸收幾率依賴于兩個(gè)入射光子在空間和時(shí)間上的重合程度(兩個(gè)光子必須在10-18秒內(nèi)到達(dá))。雙光子吸收截面很小，只有在具有很大光子流量的區(qū)域的熒光團(tuán)才會(huì)被激發(fā)。因此所用激光器多為鈦寶石激光器，可以達(dá)到皮秒或者飛秒級(jí)的掃描速度，且具有非常高的峰值功率和較低的平均功率，從而可以減小或者消除光漂白和光毒作用。主要的是在一個(gè)很小的范圍提供非常高密度的光子，可以保證雙光子的同時(shí)激發(fā)。

　　4.雙光子激發(fā)的優(yōu)點(diǎn)是什么?

　　1)增加了染料的選擇性：共聚焦系統(tǒng)的激光器(Ar, Ar/Kr, HeNe)的激發(fā)光范圍在 488nm - 647nm.

　　這就意味著想用紫外激發(fā)熒光染料的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行，例如使用 DAPI , Hoescht.

　　而雙光子的激發(fā)波長(zhǎng)是單光子的兩倍，所以紫外激發(fā)的染料能被近紅外光激發(fā)。

　　2)減少光漂白：因?yàn)楣馄诇p少的減少使得用 CFP/YFP 做熒光共振能量轉(zhuǎn)移( FRET )的實(shí)驗(yàn)的成功率提高。

　　3)無(wú)需特殊的物鏡：從硬件的角度出發(fā)，用近紅外光的波長(zhǎng)激發(fā)紫外激發(fā)染料不需要特殊的紫外光學(xué)組件。

　　4)提高信噪比：激發(fā)光波長(zhǎng)和發(fā)射光波長(zhǎng)具有很大的差別，提高了信噪比。

　　5)漂白局限于焦點(diǎn)處：因?yàn)闊晒饧ぐl(fā)只發(fā)生在物鏡的焦點(diǎn)上，所以就不需要共聚焦針孔了。這樣提高了光的檢測(cè)，而且光漂白只發(fā)生在焦點(diǎn)上。

　　6)更容易穿透標(biāo)本：紅外波長(zhǎng)的光不易被細(xì)胞散射，能穿透更深的標(biāo)本。

　　5.相對(duì)于激光掃描共聚焦顯微鏡，雙光子顯微鏡做的大改進(jìn)是什么?

　　1)減少了光漂白。

　　2)減少了光毒性。

　　3)不易散射，更易穿透厚樣品，諸如腦片。